小编有幸学习到一篇真菌分子诊断的文章，医院的需求，深受启发，尤其真菌通用PCR检测（PanfungalPCRAssays）在筛查和诊断中的临床意义，值得我们重视。本软文摘录其中的一部分内容分享同道，有兴趣的朋友可以查阅原文。
原文研究背景
侵袭性真菌病(IFD)给免疫功能低下和其他重症人群带来了越来越大的负担，早期准确检测和识别病原体对于患者至关重要。虽然培养和镜检仍然是诊断IFD的金标准，但这些方法的敏感性和特异性是有限的；培养过程缓慢(长达4周)，并依赖于特定的培养基。同时，从环境和临床获得的耐药真菌正在出现，具有内在耐药的菌种可能被遗漏。因此，需要更灵敏、更有针对性的IFD诊断系统。
本文将集中讨论从临床标本中直接检测真菌的现代分子诊断方法-通用PCR法，真菌通用PCR法可以直接从临床标本中快速检测/鉴定真菌属和部分种类，并具有良好的特异性和实用性。
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通用PCR检测（PanfungalPCRAssays）
通用PCR检测，即采用真菌通用引物来检测临床标本中存在的“所有”真菌DNA。首选靶区是rRNA基因簇一个或多个区域，即：ITS1和ITS2和28SrRNA基因的D1/D2区域(图1)。
图1rRNA基因簇示意图
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通用PCR检测可以检测不同标本类型的真菌，包括对新鲜组织、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织、脑脊液(CSF)、体液、血液和支气管肺泡灌洗液(BALF)都具有良好的准确性和特异性，但标本类型之间的敏感度存在差异。目前的经验是，在新鲜组织和FFPE、或无菌血液中发现真菌成分，如孢子或菌丝，通用PCR检测的意义更大。
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真菌的鉴别诊断应该与组织病理或镜检发现保持一致。如果临床样本中未见真菌形态，又高度疑是IFD，专家认为，通用PCR检测是培养方法的很好补充手段，特别是培养阴性不能排除真菌病的时候。
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通用PCR检测的另外一个明显好处是可能发现意想不到的病原体（以曲霉属为例，最常见的病原体为烟曲霉，若单独进行烟曲霉核酸检测，就不能发现构巢曲霉这种不常见曲霉，而曲霉通用PCR检测则可以避免曲霉漏检）。
此篇，小编将主要摘录曲霉通用PCR检测的相关数据与大家一同分享。
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曲霉通用PCR检测（PanfungalPCRAssaysforAspergillus）
多年来，基于PCR技术诊断侵袭性曲霉菌病(IA)的检测性能因方法、样本类型和数量、DNA提取方案、基因靶点、定义“PCR阳性”的标准不同、判定感染或排除感染的参考标准不同而存在很多差异。许多的研究都集中在使用曲霉PCR对IA的进行早期或抢先诊断，如为筛查高危血液病患者的IA。
其中，CochraneLibrary数据库对基于血液标本PCR方法早期检测和诊断IA进行了荟萃分析，结果显示：单个PCR阳性结果的平均敏感性和特异性分别为80.5%和78.5%。两次PCR结果均为阳性的平均敏感性和特异性分别为57.9%和96.2%（图2）。假设IA在特定患者人群中的平均患病率为13%，当使用两个阳性结果来定义“PCR阳性”时，曲霉PCR的PPV从36%增加到70%，而NPV保持在94%到96%；在曲霉PCR高NPV情况下，无需经验性抗真菌治疗就可以排除IA。
图2血液样本IA诊断荟萃分析
Springer等对例接受造血干细胞移植或急性白血病化疗的高危患者中证实了上述结果，确定了PCR筛查对IA早期诊断的有效性。其指出，在未接受抗真菌药物治疗的患者中，PCR的敏感性为71.4%，特异性为92.3%，PPV为62.5%，NPV为98.3%。然而，在接受曲霉药物预防的患者中，PPV下降至仅5.4%，而NPV上升至%，表明PCR筛选的结果适用于未接受初级抗霉菌预防的患者。
为了协调各研究之间的测试性能，ISHAM的欧洲曲霉PCR计划(EAPCRI)工作组已对曲霉PCR方法进行了标准化，以提高分析性能和临床有效性，其中对全血、血清和血浆中进行曲霉PCR的实验室应采用这些建议;同时对BALF进行类似的标准化流程也在验证中。
全血、血清或血浆样本是否可以通过PCR筛查或诊断IA的争议依旧不断。与全血相比，血清或血浆的处理在技术上要求更低，因为它便于自动化处理，便于标准化，并降低了污染的风险。一项基于EAPCRI标准的方法对所有三种血液成分的研究进行了分析。研究发现，与血清和全血相比，血浆PCR的敏感性最高;然而，全血的特异性明显高于血清或血浆（图3）；进一步结合不同血液组分的PCR检测，可以排除和诊断IA。值得注意的是，年修订的EORTC/MSG指南中，曲霉PCR已被纳入IA拟诊的真菌学标准。
图3血液样本IA诊断荟萃分析
除了用于筛查早期IA外，利用PCR检测其他临床标本(如BALF、CSF和组织)中的曲霉DNA以诊断疑似IA患者也很有用。然而，对于通用PCR而言，BALF的PCR结果无法区分定殖和感染，导致PPV相对较低（72%）。因此，欧洲临床微生物学和传染病学会(ECSMID)、欧洲医学真菌学联合会(ECMM)和欧洲呼吸学会(ERC)联合指南仅适度推荐使用BALF和CSF标本诊断IA和CNS（曲霉性中枢神经感染）；同时，PCR阴性结果有助于排除IA。
此外，Imbert等研究者在BALF中通过PCR确定真菌载量可以区分曲霉病和非曲霉病(即污染)，但不能区分侵袭性和非侵袭性形式。Avni等研究分析，利用BALFPCR法对IA诊断的总体敏感性和特异性都大于90%。
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国外曲霉PCR检测试剂盒
曲霉通用PCR检测在筛查高危患者的早期感染以及实时诊断方面已经得到确认。随着越来越多的商业化PCR试剂盒用于检测临床标本中的曲霉DNA，提供标准化的方法学和试剂的质量控制，在不久的将来可能实现更大的临床应用。
国外曲霉PCR产品主要提供通用PCR检测与单一菌种检测的混合方式（见图4），以区分不同真菌菌属，便于临床结合不同真菌菌属的致病特点，针对性用药，如英国的MycAssayAspergillus?曲霉通用PCR检测试剂盒与荷兰的AsperGenius?曲霉通用PCR检测试剂盒。
图4国外已商品化曲霉PCR检测试剂盒
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国内曲霉PCR检测试剂盒
缔蓝生物作为国内唯一一家专注于真菌核酸检测的国家高新技术企业，紧跟国际真菌PCR检测步伐，国内率先研发出曲霉通用PCR检测试剂盒与烟曲霉单一菌种PCR检测试剂盒（均为国内独家）。
该产品适用于临床疑似曲霉感染（无明显特征性症状，常表现为咳嗽咳痰、发热伴胸闷气急、肺部阴影等）的辅助诊断，以及免疫功能低下或临床危重症患者曲霉感染的排查检测，如过度使用或长期服用广谱抗生素、细胞*药物、免疫抑制剂、糖皮质激素等药物的患者，患有慢阻肺、肝硬化晚期、糖尿病晚期、肝肾衰竭、艾滋病或结核、恶性肿瘤、免疫缺陷类疾病、侵袭性真菌病史等相关基础疾病的病人及自身免疫能力低下的婴幼儿与老年群体；进行骨髓移植、实体器官移植、导管插管、放射治疗、肿瘤化疗、创伤、大手术等治疗手段的患者。
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思考与总结
原文作者从一个开放的视角对目前侵袭性真菌PCR诊断发展过程做了细致、全面的汇总，引人深思，其中对IAPCR检测发展做了详尽的总结。从文中我们可以看到IA的诊断是由血液样本逐渐发展过渡到原发病灶呼吸道样本，这其中汇集了很多专家学者的研究工作，里面有很多数据与观点值得我们学习：
真菌通用PCR可以作为培养方法的补充，在提高诊断效率上具有很大的潜力。
在常规患者中使用PCR方法通常有助于筛查和鉴别诊断，将PCR方法学引入任何疑似IFD患者的诊断流程中，以减少误诊或漏诊的可能性。
使用PCR检测非血液临床标本(如BALF、脑脊液和组织)中的曲霉DNA，可用于筛查早期IA和诊断疑似IA的患者。
两次阳性检测结果可以提高PPV。当使用两个阳性结果来定义“PCR阳性”时，曲霉菌PCR的PPV从36增加到70%，而NPV保持在94%到96%。
接受曲霉药物治疗会影响PCR的结果（PPV下降至仅5.4%，NPV上升至%）
BALF的PCR结果无法区分定殖和感染，但PCR阴性结果有助于排除IA。
文章多次提到曲霉PCR高NPV情况下，无需经验性抗真菌治疗就可以排除IA。
曲霉PCR已被纳入年EORTC/MSG修订的IA拟诊的真菌学标准指南中。
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