标准菌种的传代
按菌种说明书要求复溶菌粉,转种于适宜的增菌培养基内,称第1代(G1),复壮后转接至平板上,并在适当温度下培养适当时间,分离单个纯种菌落,此为第2代(G2)。
.菌种确认后,挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管,作为保存菌种(G2),也称传代用菌种,同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支,作为工作用菌种,此为第3代(W3)。
将第2代(G2)菌种管冷冻保存,将工作用菌(W3)于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。
取一支冷冻保存的第2代(G2)菌种转种于平板和斜面培养基上,平板上的菌种制成冷冻保存管第3代(G3);斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种,此仍为第3代(W3)。
将第3代菌种(G3)冷冻或低温保存,将生长、转种后的第2代(G2)菌种经高温灭活处理后丢弃。
按上述规程操作,直至G4转为W5为止,需重新开启冷冻干燥菌种,重复上述规程操作,保存和使用菌种。
当工作用菌种代数小于5时,在规定保存期限内,可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
传代用菌种的传代
当无标准用菌种时,可从省(市)药检所购买菌种作为传代用菌种,不需经过复溶增菌,但应划线接种确认。
将购回无异常的传代用菌种(一般为第3代),根据日常检验工作的需要量,挑取纯菌落转接斜面菌种数支,作为工作用菌种(为第4代),同时,结合菌种的代数和最长保存期限,挑取纯菌落制成浓菌悬液按“6.3.2.”的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支,作为传代用菌种(仍为第3代)。
工作用菌种的传代
当工作用菌种代数小于5时,可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
取在冰箱4~8℃保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代,并将新传代的培养物替代原有的菌种,作为工作用菌种。
也可取用“甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法”保存的菌种,进行复苏,直接作为工作用菌种。
细菌每1个月传代一次;酵母菌每2个月传代一次;霉菌及芽胞每3个月传代一次。当超过5代,须用传代用菌种传代。
传代时注意无菌操作,使菌株不死亡,不污染、不丢失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护,如工作时必须穿工作服,佩带无菌手套,实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具。如发生意外,如菌种泄漏或人员受伤,微生物学检验人员应立即向QC主管报告以便及时进行处理。
传代后,按检定菌种的编号原则编号,并在每一支菌种管上贴上标签,标签内容包括:名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交QC主管统一保管。同时及时填写《菌种传代、分离记录》(附表2)。
检定菌种的编号
采用字母加数字表示:英文缩写字母—代次—传代日期—顺序号
菌种的英文缩写字母:大肠埃希菌(E.c)、金黄色葡萄球菌(S.a)、枯草芽孢杆菌(B.s)、白色念珠菌(C.a)、黑曲霉菌(A.n)、乙型副伤寒沙门菌(S.p)
代数用一位带有下标数字的字母表示:传代用菌种用G表示;工作用菌种用W表示;如G3表示传代用菌种第3代;W3表示工作用菌种第3代。
传代日期用6位数字表示:年份取最后两位数,月、日分别用两位数。
如年1月12日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为:E.c-G3--01。
检定菌种的保管
检定菌种设专人加双锁保管,并对所保存的菌种建立《检定菌种保存、领用登记台账》(附表3)。
检定菌种的定期检查与鉴定
在菌种的保存期间,应每天检查保存菌种冰箱的温度、菌种管的塞子是否松动或生霉,并及时填写《检定菌种观察记录》(附表4),如有异常应及时处理。
菌种在保存期内均应根据菌种的特性(工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次)检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态及生化特性等项目,若发现与原菌种变异较大,应重新分离、纯化、鉴定、再加以保存,并做好《检定菌种鉴定记录》(附表5)。
所保管的菌种,不能随意转让其他单位和个人,需要时应有单位证明和批准手续方可供应。
检定菌种的领用与使用
微生物学检验人员根据检验需要,需到QC主管领取工作用菌种或传代用菌种,同时填写《检定菌种领用登记台账》相关内容。
微生物学检验人员从QC主管领取工作用菌种或传代用菌种,用于日常检验或验证试验,使用后及时填写《检定菌种使用登记台账》(附表6),以便追踪菌种使用历史