摘要
在中性粒细胞呼吸爆发期间，髓过氧化物酶使用过氧化氢和氯离子产生杀死病原体的次氯酸盐。本文描述了基于这种化学的合成抗微生物材料。氧化酶葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)使用葡萄糖、过氧化氢和卤化钠（碘化物或溴化物）串联催化两个反应。这两个连续酶促反应的最终产物是碘或溴。HRP作为卤过氧化物酶，利用GOX产生的H2O2氧化卤化物离子变成游离卤素。通常，15单位/mlHRP和25单位/mlGOX与0.8mmNaI和5mm葡萄糖反应在30分钟内生成5–7ppm游离碘。医用级聚氨酯ChronoFlexAR(CF)与GOX和HRP一起静电纺丝。将电纺纤维收集为均匀、不溶于水、柔韧的弹性体基质，平均纤维直径为1±0.2μm。CF/酶纤维的杀菌活性导致大肠杆菌和金黄色葡萄球菌减少6-log单位挑战。杀生物活性的时间过程显示E降低3-4log。大肠杆菌和S.在前5分钟内杀死金黄色葡萄球菌，并在15分钟内完全杀死（6对数）。纤维重量（0.5-30mg/ml）的剂量反应研究表明，大肠杆菌完全杀死。大肠杆菌（6对数）和至少99.99%的S。只需1毫克纤维即可杀死金黄色葡萄球菌（4对数）。纤维可重复使用，第二次使用时活性略低，连续浸泡在缓冲液中长达7天后活性显着。静电纺丝CF/GOX/HRP纤维粘附在嵌入NaI和葡萄糖的薄膜导致E完全杀死。大肠杆菌（7-log单位）和MRSA（6-log单位减少）在37°C下1小时内。
介绍
几十年来，设计真正的杀菌表面一直是公共卫生和国防科学家难以实现的目标。浸出抗菌剂的表面具有在一段时间内表现良好的优势，尽管必须预先选择浸出的杀菌剂。其他表面含有非浸出杀生物剂，在接触时会杀死。然而，这些表面受到死细胞堆积的挑战，随着时间的推移会降低它们的功效。仍然需要具有非常广谱的杀生物活性、可以重复使用并且通过不会导致抗性菌株出现的机制进行杀灭的表面。医生面临着对充满细菌的环境进行消毒的挑战，一百多年来，他们一直使用碘制剂定期清洁皮肤。
某些过氧化物酶，例如来自真菌Caldariomyxesfumago的氯过氧化物酶(CPO)、大豆过氧化物酶，以及来自海洋褐藻(Pelvetiacanaliculata)和红藻(Coranillinaofficinalis)的钒过氧化物酶]在过氧化氢存在下催化卤离子氧化成游离卤素。Klebanoff描述了中性粒细胞酶髓过氧化物酶(MPO)与卤化物盐（例如碘化钠、溴化钠或氯化物）以及H2O2对大肠杆菌和嗜酸乳杆菌的抗菌活性。MPO在H2O2存在下形成游离卤素
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杀死5×E。在pH5.0和37°C下30分钟内检测大肠杆菌细胞/ml。乳过氧化物酶发挥类似的作用，但通常比MPO活性低，而且两种酶都热不稳定[7]。我们之前已经注意到，辣根过氧化物酶(HRP)在pH值为5的过氧化氢和碘盐存在下起碘过氧化物酶的作用[9]。这些酶促卤过氧化反应模拟了由氯离子和H2O2产生的次氯离子的内源性在某些哺乳动物细胞中。MPO和LPO有助于维持人类皮肤成纤维细胞、中性多形核(PMN)白细胞和单核细胞中氯离子和次氯酸根离子的稳态。当嗜中性粒细胞被激活时，与吞噬作用一起发生，它们会经历呼吸爆发。MPO催化在呼吸爆发期间形成的过氧化氢在细胞内的转化，并将氯离子转化为次氯离子。这些产生游离卤素的酶促氧化还原反应在人PMN白细胞的杀菌活性中起关键作用。由于大自然通常最了解，我们决定将这些白细胞杀生物氧化还原反应结合到合成材料中，以赋予它们杀生物功能。
过氧化氢作为卤代过氧化物酶底物的使用可能由于其挥发性和不稳定性引起的安全和储存问题而受到限制。使用仿生策略，我们开发了一种原位形成H2O2的生物催化过程。葡萄糖氧化酶(GOX)催化葡萄糖转化为γ-葡萄糖醛酸，同时产生H2O2[11]。GOX催化的H2O2形成已广泛用于各种诊断和医疗应用。
尽管生物催化剂显示出高催化效率和精细的选择性，但它们在恶劣的环境和工业操作条件下往往不稳定。固定化构成了克服这种稳定性问题的策略。聚合物因其有吸引力的热机械和化学性质而被用作基质。合成聚合物通常是酶固定的首选材料，尽管文献]中描述了涉及使用天然聚合物（如纤维素）的各种示例。传统的酶固定可以通过在聚合过程中截留在聚合物中，通过选择性或非选择性吸附在聚合物材料上，或通过共价连接到支持物上来实现。后一种策略通常需要激活聚合物表面或修饰酶以实现共价酶-支持连接。生物塑料已在水性或非水性介质中合成。用于生物塑料合成的介质的选择可能会影响可掺入聚合物中的酶量，以及一旦固定后其活性保留和稳定性。我们之前已经证明，在非常规介质存在下形成含蛋白质的聚合物有利于获得可用于有机介质的酶-聚合物系统。用于生物塑料合成的介质的选择可能会影响可掺入聚合物中的酶量，以及一旦固定后其活性保留和稳定性。我们之前已经证明，在非常规介质存在下形成含蛋白质的聚合物有利于获得可用于有机介质的酶-聚合物系统。用于生物塑料合成的介质的选择可能会影响可掺入聚合物中的酶量，以及一旦固定后其活性保留和稳定性。我们之前已经证明，在非常规介质存在下形成含蛋白质的聚合物有利于获得可用于有机介质的酶-聚合物系统。
一旦固定化，含酶材料的表面积对活性有显着影响。使聚合物表面积最大化的技术包括静电纺丝，它已被用于形成由直径为0.1-1微米的纤维组成的均质基质。电纺聚合物的主要好处是形成了相当均匀的纤维群体，具有相对较高的表面积，用于捕获酶，从而实现快速的界面反应，从而产生有效的生物活性涂层。例如，现场Patel等人将HRP封装在电纺多孔二氧化硅纤维中。通过静电纺丝生产的含HRP的非织造垫具有高表面积、极高的孔隙率和改善的热稳定性。固定HRP时静电纺丝的另一个重要优势是对含血红素的蛋白质进行化学修饰可能很困难。表面活性剂稳定的胰凝乳蛋白酶乳液与甲苯可溶性聚苯乙烯一起电纺，形成稳定的纳米纤维复合材料，该复合材料由掺入聚合物中的活性酶组成。通过静电纺丝将模拟白细胞的酶结合到聚合物基质中，可以创造出具有独特的表面抗病原微生物杀生物活性的新型生物塑料材料。产生的游离碘不会产生耐药菌株，对所有已知类型的抗生素耐药性都有效。各种缓释碘制剂已被证明是对抗耐甲氧西林的有效消毒剂金黄色葡萄球菌(MRSA)和增强MRSA感染溃疡的伤口愈合。因此，酶聚合物基质可以作为一种药物递送系统，用于产生易腐烂的游离卤素，作为高活性和快速消毒剂，医院以及军事和国内领域的患者。
部分片段材料
辣根过氧化物酶(HRP)(U/mg)和黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOX)(U/mg)、碘、溴、碘化钠、溴化钠、部分皂化(87%)聚乙烯醇(PVA)、六氟异丙醇(HFIP)和葡萄糖购自SigmaAldrichChemicalCompany(StLouis)。聚氨酯ChronoFlexAR。ChronoFlexAR是通过将二苯甲烷4,4-二异氰酸酯与聚碳酸酯混合而成在GOX和HRP存在下电纺聚氨酯的形态在酶的存在下，通过静电纺丝医用级聚氨酯ChronoFlexAR(CF)实现了GOX和HRP在聚合物中的截留。当CF在指定的静电纺丝条件下以7.5-12.5%w/v的范围溶解在HFIP中时，获得均匀的静电纺丝CF纤维（在材料和方法中描述）。在HFIP中以1ml/hr的流速用7.5%w/v的CF静电纺丝过程中得到的聚合物纤维的形态通过扫描电子测定结论酶聚合物纤维的稳定性和可回收性表明通过静电纺丝可以有效地将GOX和HRP截留在聚氨酯基质中。我们还用PEG化GOX和HRP电纺与ChronoFlex聚氨酯一起进行了实验，以努力提高电纺纤维中的酶稳定性，但PEG化并没有增加聚合物基质中酶的活性或耐久性（数据未显示）。由于电纺酶聚合物
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